Агар для определения ДНКазы (DNAse Test Agar)

Среда для идентификации бактерий из клинических образцов на основании
активности дезоксирибонуклеазы

Формула в граммах на литр

Казеиновый пептон 15,0 Соевый пептон 5,0

Хлорид натрия 5,0 Дезоксирибонуклеиновая кислота 2,0

Бактериологический агар 15,0

Конечная величина pH 7,3±0,2 при 25°C

Приготовление

Развести 42 г среды в 1 литре дистиллированной воды. Тщательно перемешать и нагреть. Часто помешивая, довести до кипения. Кипятить в течение минуты до полного растворения. Стерилизовать 15 минут при 121°C. Охладить до 45–50°C, тщательно перемешать и разлить в чашки Петри. Готовая среда имеет янтарный цвет, слегка опалесцирует, должна храниться при 8–15°C.

Использование

Агар для определения ДНКазы применяется для дифференциации микроорганизмов с использованием соотношения между коагулазо-положительной и ДНКазной активностью. Особенно эта дифференциальная среда рекомендуется для идентификации патогенных стафилококков.

Казеиновый и соевый пептоны являются источниками питательных веществ, необходимых для роста микроорганизмов: азота, витаминов, минеральных солей и аминокислот. Хлорид натрия поддерживает осмотический баланс. Дезоксирибонуклеиновая кислота дает возможность обнаружения ДНКазы, которая ее деполимеризует.

Посеять тестируемый материал широкополосным штрихом (длиной 2 см) на поверхности чашки. На одну и ту же чашку можно одновременно нанести 4–5 разных образцов. Инкубировать 18–24 часа при 35±2°C.

Получив колонии, добавить одну каплю 1 N соляной кислоты или несколько капель 0,1% раствора толуиди­нового синего. Для некоторых штаммов необходимо увеличивать концентрацию HCl до 2 N для получения хорошей положительной реакции.

В присутствии разбавленной соляной кислоты в результате реакции с ДНК в среде культивирования образуется мутный осадок. Колонии микроорганизмов, продуцирующих дезоксирибонуклеазу, будут окружены прозрачной зоной, содержащими фракции растворимых нуклеотидов деградированной ДНК, которые не осаж­даются соляной кислотой. Толуидиновый синий формирует окрашенные комплексы с полимеризованной ДНК.

Результаты

В присутствии соляной кислоты:

 ДНКазо-положительный тест:

прозрачная зона, окружающая посевной штрих, причем остальная часть чашки остается матовой. Для формирования положительной реакции нужно приблизительно 5 минут.

 ДНКазо-отрицательный тест:

отсутствие прозрачной зоны вокруг посевного штриха.

В присутствии толуидинового синего:

 ДНКазо-положительный тест:

появление розового ореола вокруг посевного штриха. Остальная часть чашки остается синей.

 ДНКазо-отрицательный тест:

отсутствие розового ореола вокруг посевного штриха.

Для некоторых требовательных организмов может оказаться необходимым добавление крови. При добав­лении разбавленной соляной кислоты образуется четкий матовый ореол вокруг ДНКазо-положительных орга­низмов. ДНКазная среда с кровью не должна использоваться при изучении гемолитических реакций, и кровь следует добавлять только в случае крайней необходимости.

Микробиологический тест

Следующие результаты были получены при использовании среды на тестовых культурах после инкубации при температуре 35±2°C и наблюдались через 18–24 часа.